古代の口腔マイクロバイオームは、新石器時代の食事の農業への段階的な移行をサポートしています

Nature Communications volume 13、記事番号: 6927 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

ヒトのマイクロバイオームは、最近、宿主の生命と健康に関する貴重な情報源となっています。これまでのところ、新石器時代の農業への移行など、私たちの歴史に沿った重要な段階でそれがどのように進化したのかについてはほとんど知られていません。ここで我々は、旧石器時代の狩猟採集民と、イタリアの同じ制限地域に居住していた新石器時代および銅器時代の農民を比較し、この移行期に口腔マイクロバイオームが経験した進化に光を当てます。私たちは、76 個の歯石口腔マイクロバイオームの分析と、埋め込まれた植物の残骸の特定から得られる食事情報を統合します。新石器時代の後期には狩猟採集民のマイクロバイオーム構成からのより強い逸脱が検出されましたが、移行の初期段階ではそれほどではありませんでした。私たちの発見は、農業の導入が宿主のマイクロバイオームに影響を与えたことを示しており、調査された集団内での段階的な移行の仮説を裏付けています。

過去 10 年間に、いくつかの研究により、マイクロバイオームが人間と周囲の環境との間のインターフェースの一種であることが特定されました。ヒトのマイクロバイオームは、いくつかのメカニズムを通じて宿主の健康に影響を与えることができ 1,2、さらに宿主の遺伝学よりも、宿主の生活条件 (ライフスタイル、環境など) に関連する変数によって形成されます 3,4。ヒトマイクロバイオームのメタゲノム解析が始まって以来、世界中の異なる集団間で腸内マイクロバイオーム組成に大きなばらつきが存在することが強調されてきました5,6。それにもかかわらず、これらの微生物群集が人類の進化の過程でどのように発生し、宿主と共進化したのかは未解決の疑問のままです。

古代 DNA (aDNA) 研究により、これらの複雑な微生物群集が時間の経過とともにどのように進化して現在の組成に到達したかを説明できる可能性があり、さらに、過去の社会、文化、生活条件に関する重要な情報が得られる可能性があります 7,8。研究者らは現在、人類関連の微生物群集の進化の解明に大きく貢献できるツールとして、糞石（つまり、糞便の化石）と歯石から古代のマイクロバイオームを研究することを検討している9,10。

ヒトのマイクロバイオームの進化に関する未解決の疑問の 1 つは、新石器時代の農業への移行が口腔マイクロバイオームの構成と生物多様性をどのように形作ったかに関連しています。現代人を対象に行われた分析では、伝統的または狩猟採集社会と都市社会を比較した場合、口腔微生物生態の変化が検出されました11、12、13、14。しかし、過去の農業への移行に焦点を当てた最近の研究では、物議を醸す結果が示されています。たとえば、古代の口腔マイクロバイオームの予備データは、新石器時代の移行に関連する細菌種の存在量の変化を示唆していましたが、口腔マイクロバイオームの進化に関する最近の研究では再現できませんでした8,15。南ヨーロッパでの追加研究では、移行に関連する変異はほとんど見出されず、主に細菌ゲノム変異の地理的パターンが特定されました 16。これまで、古代新石器時代のマイクロバイオームに関する研究は、主に、明確な生態学的条件と生存戦略を特徴とする広い地理的領域に分布した小さなサンプルグループに依存しており、地理的および食生活による偏りが生じている可能性があります。実際、さまざまなマイクロバイオーム源で観察されたように、歯垢に生息する微生物群集は、食事、生態および生活条件の影響を受けるようです17、18、19。さらに、考古学的証拠は、新石器時代の移行は一枚岩の出来事ではなく、同世代のコミュニティ間で採用された生存戦略に違いが生じたことを示唆しています20、21、22。この証拠は、サンプルサイズが小さく、生態学的条件が異なることを特徴とするさまざまな新石器時代のコミュニティを比較するときに、文化的変化ではなく地理的な変動パターンが主に検出される理由を説明する可能性があり、したがってこの疑問は未解決のままです。したがって、考古学的背景と生態学的背景の両方に注意を払うことが、口腔マイクロバイオームに対する農業移行の影響を文脈化するための基本となります。

イタリアでは、紀元前 6,200 年頃、半島の南東部、現在プーリアとして知られる地域で農業への移行が始まりました。この地域では、レバントからの住民が地中海を渡る移動ルートをたどってこの土地に到達しました23。ここでは、狩猟採集民から農耕生計への移行がイタリア初のものであり、西ヨーロッパでは最も古いものとして記録されています23。最初の段階は、「Impressed Ware」と呼ばれる典型的な種類の陶器生産を行う小さな村で組織されたいくつかの家族グループによって特徴づけられました23。次の 2000 年にわたって、これらのコミュニティは北に広がり、より複雑な社会構造を発展させ、また、地域資源や環境条件に応じて農業生存システムを適応させました24。過去 10 年間、この地域は新石器形成のダイナミクスを再構築することを目的とした複数の古食生活および古生態学的調査の対象となっており、移行時の宿主とマイクロバイオームの関係を調査するための完璧なケーススタディとなっている 24,25,26 。全体として、この地域の新石器時代は 4 つの主要な文化段階に分かれています。前期 (印象陶器文化に相当)、中期 (パッソディコルボ文化に相当)、中期後期 (セラダルト文化に相当)、新石器時代後期 (ダイアナ文化に相当)23.

したがって、本研究の目的は、食事、文化、環境情報を統合して、新石器時代の食事の変化が口腔マイクロバイオームに及ぼす影響に関する疑問に取り組むことです。私たちは、地理的偏りの可能性を最小限に抑え、ケーススタディとしてイタリア中南部（特にプーリア地域）にのみ焦点を当て、イタリアの文化的および食的背景を考慮しながら、農業移行に関連したマイクロバイオーム構成の進化を調査するための代替アプローチを提案します。それぞれのコミュニティ。まず、パグリッチ洞窟（紀元前 31,000 ～ 11,000 年）から採取された 9 つの後期旧石器時代の狩猟採集サンプルを分析します。これは、農業以前の微生物叢をさらに詳しく説明するため、また新石器時代の特異性と比較するための地域の参考資料を入手するためです。現在まで、この地域では中石器時代の個体は検出されていません。移行に関連する変化をより適切に扱うために、新石器時代 (紀元前 6200 ～ 4000 年) から銅器時代 (紀元前 3500 ～ 2200 年) までの一連の 67 サンプルに焦点を当て、新石器時代を構成する 4 つの段階すべてを横断します。地域と異なる文化的背景に対応しています。さらに、古代の歯石の有益な内容を拡張するために、メタゲノムデータと顕微鏡分析を組み合わせた統合アプローチを適用して、消費された植物に関する食事情報を取得しました。我々は、調査対象集団のマイクロバイオーム組成におけるこれまで記載されていない2つの変化を特定した。最初の変化は地元の狩猟採集コミュニティと新石器時代の農民の間で起こりましたが、2番目の予期せぬ大きな変化は新石器時代の後期に確認されました。分類学的および機能的な変化の一部は、おそらく生存戦略の変化によって引き起こされたと考えられます。

後期旧石器時代（PA）の狩猟採集民、新石器時代以降の銅器時代（CA）のサンプルを考慮し、さまざまな新石器時代のすべての段階を横断して、イタリア中南部から79のサンプルを収集しました（補足データ1）。前期新石器時代 (EN)、中期新石器時代 (MN)、中期新石器時代の最終部分 (FMN)、後期新石器時代 (LN)。収集されたサンプルのうち 76 個のメタゲノムプロファイルが調査されました。サンプルあたり平均 2,800 万リードが生成されました (補足データ 2)。これらのうち、平均 12.94% のリードが細菌と古細菌に割り当てられ、真核生物にはごく一部 (平均 0.01%) のみが割り当てられました。取得された古代のマイクロバイオームプロファイルは、他の古代に公開された口腔マイクロバイオームおよび現代の口腔サンプルとともにクラスター化されました (補足データ 3 および補足図 1)。結果の堅牢性を確認するために、Sourcetracker分析を通じて結果を裏付けました。そこでは、古代サンプルの大部分（71）が口腔マイクロバイオームプロファイル（>90％）との強い付着を示しました（補足図2）。少数のサンプルのみが汚染プロファイルを示したため、さらなる分析から除外されました。

イタリア半島中南部にわたる考古学的遺跡分布のサンプル。サイトごとのサンプル数は括弧内に示されています。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。マップは、R ソフトウェア上のパッケージ rnaturalearch (v 0.1.0) を使用して生成されました。

データセット全体で 0.02% を超える相対存在量を示した、最も豊富な微生物種を選択しました。このしきい値により、存在量の少ない種やシングルトンを回避して、合計 49 種を取得することができました。その結果、得られた種の脱アミノ化プロファイルが検証されました (補足データ 4 および補足図 3)。すべてのサンプル間で近い脱アミノ化プロファイルが検出されましたが、時間の経過とともに発生する有意な違いは見出されませんでした（タフォノミック情報の詳細については、補足説明および補足図4および5を参照）。

サンプルの類似性を調査するためにネットワーク分析を実行し、5 つの異なるクラスター (C1 ～ 5) を検出しました (図 2a)。クラスターの細分化は、PCoA 表現に対する PERMANOVA と ANOSIM テストを使用して検証され、マイクロバイオーム組成によって真に影響を受け、他の交絡因子 (つまり、抽出またはライブラリーのバッチ、または読み取り数) には関連していないことが確認されました (補足図 6、7)。および補足データ 5a および b)。ランダムフォレスト分類によれば、これらのクラスターの区別を引き起こす主な要因として期間が特定され、地理的位置は二次的な要因であることがわかりました (図 2b)。したがって、時間と地理の混合効果が考えられ、年代学的な時代は地理よりもわずかに大きな影響を及ぼします。実際、クラスターと期間の間の関連分析（図2cおよび補足図8）は、最初のクラスター（C1）がPA期間に有意に関連しているのに対し、2番目（C2）は主に初期（EN）に関連していることを示しました。 ) および中期新石器時代 (MN) のサンプル。中期新石器時代の終わり（FMN）に属するパラジャーノの遺跡は、C3 と C5 の両方に関連しており、同じ遺跡内にさらに下部構造が存在する可能性が示唆されています。 C3 の大部分が同じ墓 (PT10.x) に属するサンプルから構成されているのに対し、C5 はパラジャーノで見つかった異なる埋葬に属するサンプルから構成されている点は注目に値します。最後に、C4 は、地理に関係なく、後期新石器時代 (LN) および銅器時代 (CA) の期間と大きく関連しています。

a サンプル間のネットワーク分析。エッジの厚さはサンプル間の非負の類似性を示す重みに基づいており、エッジの長さは Aitchison 距離に基づいてノードの距離を表します。ノードの色は、階層クラスター分析によって識別されたクラスターによって定義され、ノードの周囲の黒い境界線の色がハブを識別します。 b ランダムな森林分類分析の結果。クラスターの違いの基礎を形成する主な変数としての期間と地理 (サイト) の重要性が強調されていますが、死亡年齢 (年齢) は識別されていません。 c パネルaで報告された、調査された時間（すなわち年表）、文化的背景（2番目のブロック）、選択された遺跡（3番目のブロック）、およびクラスター分析の結果（C1〜C5）との対応。「文化的背景」ブロックでは、各新石器時代文化が異なる色で定義されており、考古学的遺跡 (3 番目のブロック) と「クラスター」ブロックの見出しで報告されている特定の新石器時代との関連性が強調されています (つまり、EN 、MD、FMN、LN）。最後のブロック (つまり、「クラスター」と呼ばれる) では、サンプル番号が x 軸に、クラスターの注釈が y 軸に表示されます。各バーの色は、パネル a で報告されているクラスターの色に関連付けられています。各バー内では、特定のクラスターに含まれるサンプルの割合が太字で報告されます。ここで、クラスター行に続いて、PA サンプルが最初のクラスター (C1) 内にまとめられ、EN と MN が C2 内にあることがわかります。 LN と CA は特に C4 に存在しますが、FMN は C3 と C5 に分かれています。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

この証拠は、PA狩猟採集民のサンプルに関連する特定のマイクロバイオームプロファイルの存在を示唆しており、さらに、同じ新石器時代内であってもいくつかの差異が検出可能であることを示唆している。特に、この地域の新石器時代移行期の最初の数世紀に属するサンプルは、それらの間で非常に類似したマイクロバイオーム組成を示し、LN 期および CA 期に対応するサンプルとは明らかな違いを示します。 DESeq2 分析から 42 種がクラスター間で異なる分布をしていることが特定され、そのうちのいくつかは口腔マイクロバイオームのよく知られた生態学的複合体に含まれていました 27 (図 3a-e、補足データ 6)。同じ複合体に属する種のほとんどは、代謝的に相互依存し、生態学的に関連していることが予想されるように、同様の傾向を示します27。これらの複合体を特徴づける種の中には、2 つの主な分類学的傾向が観察できます。1 つは PA サンプルではあまり表現されていないが、新石器時代移行の始まりとともに増加し始める種です。もう 1 つは、PA サンプル内でより多く存在する種が時間の経過とともにゆっくりと減少し、LN と CA で最低レベルに達する傾向があるという 2 番目の傾向です。赤（ポルフィロモナス・ジンジバリス、タンネレラ・フォーシシア、トレポネーマ・デンティコーラ）、オレンジ（カンピロバクター・グラシリス、カンピロバクター・レクトゥス、カンピロバクター・ショーエ、プレボテラ・インターメディア）、緑（カプノサイトファーガ・エンドテリアリス、カプノサイトファーガ・ヘモリティカ、カプノサイトファーガ・オクラセア、カプノサイトファーガ・スプティグ）に属する重要な種ena および Eikenella corrodens) 複合体最初のトレンドに従います。したがって、それらはPAサンプル中にわずかに存在し、その後、新石器時代の初めに徐々に多く存在するようになりますが、この期間の終わりになって初めてそれらは最高の存在量に達します。また、Pophyromonas gingivalis は、MaAsLin 分析から C4、つまり LN/CA 期間と正の関連があったのに対し、Campylobacter gracilis は C2 と C4 の両方に関連していました (補足図 9 および補足データ 7)。

レッドコンプレックス。 b オレンジコンプレックス。 c 紫色の複合体。 d 黄色の複合体。グリーンコンプレックス。他の重要な口腔種は補足図10に報告されています。サンプル（n = 71）は点で表され、種に応じて色付けされています。箱ひげ図は次のように定義されます。最小値、最大値、および中心値は、それぞれ 25、75、および 50% の分位数を表します。中央値は 50% 分位数で表されます。上ヒゲと下ヒゲは、それぞれ 75 パーセンタイル以上または 25 パーセンタイル未満の 1.5 四分位範囲内にあるデータの最大値/最小値です。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

紫色（放線菌属）および黄色（ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・オラリスおよびストレプトコッカス・サンギニス）複合体からの分類群は第二の傾向に従い、PA期間中に多く存在し、時間の経過とともにその存在量が減少しました。この意味での紫色の複合体からの唯一の例外は、Actinomyces sp. でした。口腔分類群 414 (図 3c、上のプロット)。さらに、このケースでも、MaAsLin の結果により、引用されたすべての連鎖球菌属の強い負の関連性が確認されました。ほぼすべての新石器時代およびCAクラスターと（補足図9）、一方、放線菌ネスランディおよび放線菌スラックイとPA時代との正の関連が見出されました。

口腔マイクロバイオームの他のメンバー、例えば Olsenella sp. などは時間の経過とともにその存在量が大きく変化しました。口腔分類群 807、パルビモナスミクラ、デスルフォミクロビウムオラレ、オットウィア sp. 口腔分類群 894 は新石器時代のすべてのサンプルに広く分布しているようですが、Streptococcus sp. 口腔分類群 061、Abitrophiadefectica、および Klebsiella pneumonieae が PA データセット内で濃縮されました（補足図 10）。オルセネラ属 MaAsLin は C2 と C4 の両方、したがって 2 つの主要な新石器時代クラスターとの正の関連性を強調したため、口腔分類群 807 は新石器時代への移行との強い関連性を示しましたが、Desulfomicrobium orale は特に C4 クラスターと関連していました。

新石器時代の最初の段階（EN および MN）のサンプルは、異なる考古学的遺跡に由来しているにもかかわらず、非常に均質な分類学的プロファイルと、PA 期と LN/CA 期の中間位置にあると思われる微生物組成を示しました。したがって、新石器時代の第 1 段階は、PA と LN/CA のマイクロバイオーム構成の 2 つの極端の間の一種の「移行状態」を構成していると仮説を立てることができます。これらは、LN および CA と共通の要素によって特徴付けられ、同時に狩猟採集民のサンプルの組成からそれほど離れていないようです。

分類学的構成に加えて、以前の分析を裏付け、これらの変化が微生物の遺伝的機能パッケージにどのように反映されるかをテストするために、微生物の機能も特徴付けました。分類学に基づいたクラスターのそれぞれに特異的なものとして、いくつかの KEGG オーソログが検出されました (補足図 11)。

炭水化物代謝に関連するKEGGオルソログ（ピルビン酸、プロパン酸、アスコルビン酸、アミノ糖、デンプン代謝など）は、PAサンプルに特に豊富に存在することがわかりました（図4a）。これらの特性は、主に、このグループのサンプル内でより高い連鎖球菌の存在と、宿主のアミラーゼタンパク質に結合する能力に関連していることが最近判明しました 8,28。ただし、新石器時代のサンプルはすべて、ガラクトース代謝やグリオキシル酸/ジカルボン酸代謝、グリカン経路の増強など、炭水化物代謝内の他の特徴が豊富です（補足図12A）。

パネル a と b は、PA 期から CA 期までの炭水化物とアミノ酸の代謝の違いを報告しています。パネル c は、Chen et al.91 の分類に基づいて、時間の経過に伴ういくつかの病原性因子の増加を表しています。期間で割ったサンプル (n = 71) が X 軸に、相対存在量が Y 軸に表示されます。箱ひげ図は次のように定義されます。最小値、最大値、および中心値は、それぞれ 25、75、および 50% の分位数を表します。中央値は 50% 分位数で表されます。上ヒゲと下ヒゲは、それぞれ 75 パーセンタイル以上または 25 パーセンタイル未満の 1.5 四分位範囲内にあるデータの最大値/最小値です。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

リジン生合成、グリシンおよびシステイン生合成など、アミノ酸経路に属する複数の重要なオルソログが時間の経過とともに増加するようであり、これらはLNおよびCAサンプル中でより高い存在量に達します（図4b）。

ビタミン代謝の中でも、特にビタミンBに関しては、時間の経過とともに変化する重要な経路が見つかりました（補足図12B）。細菌におけるコバラミン（ビタミンB12）への生合成経路の一部である酵素の違いは、PAと新石器時代のサンプルの両方に存在します。コバルト-プレコリン-6B (K02191) および L-スレオニンキナーゼ (K16651) は主に PA サンプル内に存在し、時間の経過とともに減少する傾向にありますが、パーコリン-6Y C5,15 メチルトランスフェラーゼ (K00595) およびアデノシルコビンアミド-GDP リバゾールトランスフェラーゼ (K02233) は) 新石器時代を通じて増加します。新石器時代のサンプル、特に LN と CA は、葉酸代謝およびリポ酸代謝によって 1 炭素プールが豊富です。リポ酸は、細菌の毒性と病原性に影響を与えると考えられるもう 1 つのビタミン B 複合体です 29。

興味深いことに、新石器時代のコホートの間で病原性因子の全体的な増加が検出されました（図4c）。細菌の運動性、免疫回避、抗食作用およびエンドトキシンに関与する KEEG オーソログは、時間の経過とともに相対存在量が徐々に増加し、LN および CA で最高レベルに達しました。これらの病原性因子のレベルの増加に寄与した種は、P. gingivalis、T. forsythia、P. intermedia、Capnocytophaga ochracea、およびFusobacterium nucleatumでした。

全体として、分類学的分析で観察されたように、EN と MN の両方に属する被験者は非常に近い機能構成を持っていました (探索的クラスター分析で強調表示されているように)。これは、PA と MN で観察された 2 つのより異なる状態の間の一種の中間位置でした。 LN-CAサンプル。

後期旧石器時代（PA）サンプルに属する 9 つの歯石サンプルからは、検出された他の種類の微小遺物と比較して、主にデンプン粒子が生成され、合計 215 個の単一デンプン粒子が得られました（補足説明および補足データ 8）。デンプン粒は主にイネ科と関連しており、特に野生のコムギ科およびアベナと関連していた。バルバタ (オート麦、細長い野生のオート麦を参照)。最後に、特定のデンプン粒が形態学的に、Nuphar lutea (黄色のスイレン) の根茎のものであることが確認されました。スイレンのデンプン粒（黄色のスイレンではない）は、ネアンデルタール人の歯石からも発見されています30。

新石器時代と銅器時代の期間については、18 個のサンプルが分析されました (補足データ 8)。全体として、2 つの形態型に属する 25 個のデンプン粒子がサンプルから回収されました。形態型 I の穀物は、コムギ科の種のタイプ A の穀物と診断できる特徴を示しました。多数の菌石の中から16個の細長い樹状突起表皮が回収された。歯石中のこれらのタイプの菌石は、小麦および大麦種の花序苞で生成されるため、通常、穀物摂取の直接の証拠であると考えられています。興味深いことに、ニチア属の多数の珪藻が回収され、その中には一般に汚染に強い多くの淡水および海洋種が含まれていました 32。最後に、新石器時代とカリフォルニア時代の 7 人の個体からの真菌胞子の回収について言及する価値があります。胞子の一部は、植物の根に関連する大きな真菌属であるグロムスに属するものとして同定されました 33 が、異なる場所に属する 2 つの新石器時代のサンプルからはいくつかの酵母の胞子が同定され、おそらく発酵食品の摂取を示唆しています。

マイクロデブリ分析の詳細については、補足説明を参照してください。

最後に、複数の MAG を組み立てる de novo 再構成を実行しました。その中で最も豊富に存在するのは Olsenella sp. であることが特定されました。口腔分類群 807 (補足データ 9、補足図 13)。したがって、我々は、異なる新石器時代に属する複数のサンプル中に存在すること、またこの移行に関連する可能性のある微生物バイオマーカーとしてすでに記載されていることから、この種をさらに調査することにしました16。予想通り、系統解析により、古代オルセネラゲノムがこの種の現代参考文献と密接に関連していることが示されましたが、それらは 2 つの異なるクラスターに分割されました。1 つは最も古いサンプルから再構成された 4 つのゲノムで構成され、もう 1 つは 2 つの CA から再構成されました。系統発生的に現代の基準に近いサンプル (図 5a)。一部の領域は古代ゲノムのすべての中で共通して欠落しており（図5b）、より最近の進化の要素に関連している可能性があります。全体として、古代ゲノムでは合計 123 の領域が枯渇しており、いくつかのタンパク質ファミリーに対応しています (補足図 14 および補足データ 10)。これらの領域の大部分には、仮説上のタンパク質のみが含まれていました。約1900 kbpと約2200 kbpに位置する2つの大きなギャップには、防御機構と他の微生物共生生物との相互作用に関与するタンパク質ファミリーが含まれていた：CRISPR関連タンパク質、抗毒素HigA、モバイルエレメント、Ficドメインタンパク質、インテグラーゼ/リコンビナーゼ、テトラサイクリン耐性ファミリー (TetR)。

パネル a は、17 の現代の Olsenella sp. と 6 つの再構築された古代ゲノム (水色のボックス) の系統解析を報告します。 PATRIC100 によって実行される参照。パネル b では、BRIG99 を使用して行われたアライメント解析を観察できます。紫色の丸はオルセネラ属を示します。口頭分類群 807 参照である一方、古代ゲノムは、それらが組み立てられたサンプルのコードによって識別されます。

ゲノム再構成の詳細については、補足説明を参照してください。

近年、考古学と人類遺伝学の分野での共同研究により、古代ヨーロッパのより詳細な全体像が明らかになってきました34,35。ただし、グローバルモザイクからはまだいくつかのテッセラが欠けています。たとえば、ヒトのマイクロバイオームの進化に関する知識は依然としてとらえどころがなく、断片的です。

本研究では、新石器時代全体を通して人類の共生生物の進化を追跡し、新石器時代のマイクロバイオームを後期旧石器時代の狩猟採集民およびその後の銅器時代の集団と比較しました。私たちは、これまで科学文献では検出されていなかったさまざまなクラスターを観察しました。これらのクラスターは、これらの集団の経時的進化をたどる特定の口腔微生物プロファイルを特徴としています。

時間の経過とともに検出された種の存在量の変化のほとんどは、生存戦略の変化（狩猟採集と農耕の間など）、または新石器時代の食生活を構成する要素の変化に関連している可能性があります。最初の区別は PA サンプルに関するもので、そのマイクロバイオームは分類学的および機能的な観点から、その後の新石器時代のものとは明らかに異なっているようです。分析された狩猟採集民のマイクロバイオームは、最終氷河期の極大期を含む長い年代に属し、おそらくその後の人口の入れ替わりがあるにもかかわらず、非常に類似しています 36,37。これは、ここで報告された微小遺物と機能的結果を動物考古学的データと組み合わせることで示唆されるように、でんぷん質の炭水化物食品に加えて、動物性タンパク質と脂肪のかなりの量の消費に基づく長年の同様の生存戦略の反映であると考えられるかもしれません。パグリッチ洞窟38,39より。 PA サンプルと新石器時代サンプルの間で特定された炭水化物経路の違いは、おそらく選択された炭水化物源の違いに関連していると考えられます。実際、微小遺骨分析により、新石器時代のサンプルと比較して、PA サンプル間で消費されたデンプン粒の分類学的ばらつきがより高度であることが明らかになりました（補足説明を参照）。これは、細菌性デンプン代謝経路の存在量がより高いことと一致しています。興味深いことに、エンバク（Avena cf. barbashi）に起因するデンプン記録の証拠が、5 人の PA 個体（3 人のグラベティアンと 2 人のエピグラベティアン）の歯石と、同じ場所の初期のグラベティアン層で発掘された砥石の両方で検出されました。これは、考えられる旧石器時代のすべての段階にわたってこの植物が消費されたという複数の証拠を提供します38。

逆に、新石器時代のサンプルは、調査されたすべての新石器時代の限られたグループのデンプン粒、および炭水化物、ビタミン、アミノ酸の代謝および病原性因子に関連するさまざまな分類学的および機能的変数によって特徴づけられました。

分類学的観点から見ると、新石器時代移行の始まりとともに、他の分類群（すなわち、オルセネラ種口腔分類群807、パルビモナス・ミクラ、 Desulfomicrobium orale や Filifactor Alocis など) が出現または大量に増加し始めました。赤とオレンジの複合体に属する細菌種は一緒に凝集し、歯周病の病原体として知られています27。それらは、宿主の結合組織に影響を与え、免疫応答機能不全を引き起こす可能性があるタンパク質分解能力を備えたいくつかの病原性因子（線毛やプロテアーゼなど）を保有しています40。最近では、P. ジンジバリスの存在は、心血管疾患、糖尿病、アルツハイマー病などのいくつかの口腔外炎症状態とも関連しており、宿主の腸内微生物組成に直接影響を及ぼしているようです41、42、43。したがって、すべての新石器時代、特に LN/CA 期に観察された病原性因子の増加は、主に赤色複合体種の存在量の増加に依存しています。全体として、新石器時代のサンプルはガラクトース代謝の存在によっても特徴付けられており、これはおそらく乳製品の消費に関連している可能性があります。ガラクトースは、二糖類であるラクトースから代謝され、牛乳およびその派生製品が主要な食事源となります44。ラクトースは、ラクトース発酵細菌の増殖を刺激することができます45。実際、微小破片の分析による酵母の胞子の同定は、発酵食品の摂取を示唆している可能性があり、これは乳源に関連している可能性があります。動物の二次製品の搾取の始まりは、一般に新石器時代以降の時期として報告されています 46 が、牛乳の消費は、鍋に残った脂質や現代のイタリアの遺跡からの動物考古学的記録によっても確認されているように、ずっと以前から始まっていました 47。いくつかの分類学的および機能的特徴は、新石器時代全体に均等に分布しているわけではなく、むしろ初期段階と後期の間に大きな違いが見つかりました。新石器時代の最初の部分（つまり、EN と MN）に属する対象は、インプレスドウェア文化とパッソディコルヴォ文化に対応し、共通の分類学的および機能的要素を共有し、PA と PA で構成される 2 つの極端の間の中間的な形質を示します。 LN-CA。この証拠は、初期段階を一種の「移行状態」と定義しており、これは主に農業移行の始まりに焦点を当てていたこれまでの分析に強力な指標が欠けていたことの説明になる可能性がある16,48。さらに、提案されたシナリオは、イタリア中南部の初期の農業コミュニティが広範囲の食物を消費し、以前の狩猟採集コミュニティとの連続性を示した安定同位体分析と一致しています26。したがって、我々の結果は、新たな生存戦略への移行は、同様に報告されているように、均質な食生活への劇的な変化ではなく、到着した新石器時代の人々が地元で入手可能な資源に強く適応したことにより、段階的かつ地域的に特異的であったという仮説を裏付けるものとなるだろう。同位体データと植物データ、および他のヨーロッパ地域での料理慣行の継続性の証拠によって分析されます49,50,51。パラジャーノの遺跡は、高度な遺跡内変動を示した唯一の遺跡であり、これはいかなる人類学的メタデータ (例えば、年齢、性別、病状) とも関連していませんでした。しかし、考古学的証拠が同じ場所に異なる葬儀モデルの存在を指摘しており、それは社会的差別を反映していると解釈されてきたことは注目に値する52。分類学的分析によれば、同じ埋葬に属するサンプルのほとんどの部分が同じクラスター (C3) にグループ化されていることを考慮すると、仮定された社会的差異は、資源へのアクセスや食事の選択の違いを示している可能性があると推測できます。

逆に、新石器時代の後半には、複数の分類学的および機能的形質により、高炭水化物/低タンパク質の食事療法が採用されたと推測されました。カプノサイトファーガ種、オットウィア HOT 894、ナイセリアエロンガタ、およびロチアアエアレアの存在が高いことは、すべて LN および CA サンプルに豊富に含まれており、ビーガンの唾液マイクロバイオームと体内の両方において、食物繊維の摂取量の増加と関連しています。プラークマイクロバイオーム、それぞれ17、19。さらに、現代のビーガン人口の口腔マイクロバイオームでは、リジン、グリシン、システイン生合成などの特定のアミノ酸経路の増加も示されており、これらは LN および CA サンプルの中でも著しく濃縮されています 19。これらの形質の存在は、LN/CA期間内の炭水化物摂取量の増加を示唆しており、同位体分析によって記録されたデータと一致し、ENからLNおよびCAまでの動物性タンパク質摂取量の減少傾向と植物性タンパク質消費量の増加を報告しています。それに伴い、新石器時代末期の南イタリアの農村における農業慣行が強化されました25,53。さらに、LN 期間中は常に、植物学的記録は、穀物およびマメ科植物の分類学的多様性の減少と、干ばつ耐性植物（例えば、オオムギおよびアインコーンコムギ - Hordeum spp.、およびTriticum monococcum-)24．この農業慣行の変化は、文化的な選択というよりも、特定の環境条件と関連しており、FMN 期と LN 期 (紀元前 4500 ～ 4000 年) の間、および LN 期から LN 期への移行期に南イタリアに影響を与えた 2 つの乾燥気候期の発生に関連しています。 CA (紀元前 4000 ～ 3500 年)24 (補足図 15)。

したがって、植物の記録と引用された同位体データおよび我々の結果を組み合わせることで、新石器時代後期における微生物組成の変化の背後にある理由は、食物成分（例えば、穀物や食用植物）の変化に関連している可能性があると仮説を立てる。おそらく地元住民は、より乾燥した気候条件に直面するためにこれらの変化を適用したと考えられ、これが以前に消費されていた食用植物の入手可能性に影響を与えた可能性があります24。食事の変化は炭水化物の摂取量に影響を与え、最終的には口腔内の種の存在量と歯垢の微生物組成を変化させました17。

LN/CA サンプルの口腔微生物群集には、赤とオレンジの複合体および病原性因子に関連する種が最も豊富に存在しており、LN および CA 個体群の口腔生態系が最近の個体群よりも悪い健康状態に陥っていることを示唆しています。祖先。この枠組みでは、主に出版された論文から抽出された人類学的分析（補足説明を参照）が、LN期とCA期の考慮されたサンプルのほとんどが口腔疾患の発生率が高いことを特徴として報告したことは注目に値します。逆に、PA サンプルは良好な口腔健康状態を示しましたが、EN/MN サンプルは歯周炎と虫歯の発生率が低いことを示しました (補足データ 1)。この傾向は、農業への移行に伴う口腔の健康状態の低下をすでに示唆していた、骨格遺骨に関する以前の研究とも一致しています54,55。

新石器時代の人々の健康状態のさらなる側面を考慮すると、珪藻の存在が検出され、人間の健康に重要な影響を及ぼした可能性がある汚染水の摂取が示唆されました56。

最後に、観察された細菌生態の変化を説明する追加の要因は、共生生物のゲノム進化にわたる遺伝的変異に関連している可能性があり、それが種の相互作用や適応に影響を与えた可能性がある。同じコミュニティ内に生息する細菌は、特に栄養素をめぐる競争が強まる生物多様性の高い環境に生息する場合、ポジティブな相互作用 (つまり協力) ではなく、主にネガティブな相互作用 (つまり競争) を共有します57。抗菌毒素は、他の病原性因子とともに、種が競争するために使用する武器であり、種間に強い負の相互作用を生み出します58。古代のオルセネラ種の分析。口腔分類群 807 のゲノムでは、現代のゲノムと比較して、主に病原性因子とバイオフィルム形成に関連する多数の欠落要素が検出されました。これは、同じニッチに生息する他の口腔種と競合し相互作用する能力が最近進化したことを示唆しています。これは、食事の変化によって加えられるより強い選択圧と相まって、最終的には口腔マイクロバイオームの生態に影響を与えたであろう。

結論として、私たちの分析は、調査対象集団における数種の口腔マイクロバイオームの存在量に影響を与える 2 つの主な変化の存在の証拠を提供します: (i) 1 つ目は、この地域での農業的ライフスタイルの導入に関連する文化的変遷に関連しています。これにより、以前の狩猟採集民のサンプルのいくつかの側面を保持しながら、マイクロバイオームの構成に初期の変更が加えられました。 (ii) 2 番目は新石器時代後期に発生し、おそらくは異なる食性要素への適応に関連しており、このとき、最初の段階で観察された変化がより顕著になり、狩猟採集民に強く存在していたいくつかの種がほぼ消滅した。おそらく、農家が独特の食事要素に徐々に適応していったためだと思われます。

地元の文化遺産監督局との合意により、紀元前約 6200 年に新石器時代が始まった同じ地理的地域 (イタリア中南部) の複数の遺跡から 79 個のサンプルが収集されました。新石器時代全体を深く理解するために、この時代の主な考古学的および文化的区分に従って、その最初から最後までの移行全体をカバーするサンプルを収集しました。印象磁器文化、紀元前 7 千年から 6 千年）、中期新石器時代（MN、紀元前 6 千年の間のパッソディコルヴォ彩色陶器に相当）、中期新石器時代の最終部分（FMN、セラディセラに相当）アルト彩色陶器（紀元前 VI 世紀末から第 V 千年紀中期）、新石器時代後期（LN、ディアナ陶器に相当、紀元前第 V 紀後半から紀元前第 IV 千年紀初頭）。さらに、我々は、パグリッチ洞窟跡（PA、後期旧石器時代のグラヴェッティアンおよびエピグラヴェッティアンの文化的文脈に対応）の同じ地域にいた以前の狩猟採集民の個体と、銅器時代と呼ばれる新石器時代以降の段階（カリフォルニア、カリフォルニア、ガウド陶器とラテルツァ陶器に相当）。口腔生物地理学に関連する潜在的なバイアスを対比するために、入手可能な場合は臼歯歯石が主にサンプリングされました（補足表 1）59。調査された遺跡、文化的背景、放射性炭素年代測定に関する詳細は、補足表 1 および補足方法で報告されています。

DNA の抽出と配列決定は、現代の DNA 汚染を避けるための検証済みのガイドラインに従って、フィレンツェ大学 (イタリア) の生物学部にある専用の aDNA クリーン研究室で 76 のサンプルに対して実施されました60。 UV 光下で 10 分間除染した後、結石を滅菌微乳棒で粗く粉砕し、同じ結石サンプルからの遺伝物質と食物残留物の共同分析を可能にする Modi et al.61 の手順 A に従って処理しました。簡単に説明すると、1 mL の抽出バッファー (0.45 M EDTA pH 8.0、0.25 mg/mL プロテイナーゼ K、0.05% Tween 20) で一晩消化した後、残留ペレットを微小残留物分析用に保管し、DNA を特定のシリカスピンカラムを使用して抽出しました。短い分子を回収するように設計されたプロトコル62。最大速度で 2 分間遠心分離した後、上清を結合バッファー (5 M 塩酸グアニジン、0.05% Tween 20、40% 2-プロパノール) 10 mL および 3 M 酢酸ナトリウム pH 5.2 400 μL とともにシリカカラム (高濃度) でインキュベートしました。 Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit、Roche Diagnostic – マンハイム、ドイツ）。洗浄バッファー (高純度ウイルス核酸大容量キット、Roche Diagnostic – ドイツ、マンハイム) で 2 回の洗浄ステップを行った後、DNA を 50 µL の TET バッファー (1 mM EDTA pH 8.0、10 mM Tris-HCl pH 8.0、 0.05% トゥイーン 20)。次に、ヌクレオチドの誤った取り込みを保持するために、ウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG) 処理を行わずに、各抽出物の 20 マイクロリットルを二重インデックス付きイルミナライブラリー 63,64 に変換しました。 2 つの 8 塩基長のインデックスの独自の組み合わせが、10 サイクルの PCR によって各ライブラリー分子の両端に追加されました。ライブラリー全体の容量を 4 つの反応に分割し、1x Pfu 反応バッファー、2.5 U Pfu Turbo DNA ポリメラーゼ (Agilent Technologies – 米国カリフォルニア州サンタクララ)、各 250 μM の dNTP および各 200 nM を含む 100 μl PCR 反応のテンプレートとして使用しました。インデックスプライマー (P5 プライマー: AATGATACGGGCGACCACCGAGATCTACACxxxxxxxxACACTCTTTCCCTACACGAGCTCTT; P7 プライマー: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGT)。サイクル条件は、95 °C で 2 分間続く活性化ステップ、その後 95 °C で 30 秒間の変性、58 °C で 30 秒のアニーリング、および 72 °C で 1 分間の伸長を 10 サイクル行い、最終伸長ステップは 72 °C で 10 分間。 PCR産物はMinElute PCR Purification Kit (QIAGEN – Hilden, Germany)を使用して精製し、25μlのTETバッファーで溶出しました。 Agilent TapeStation (D1000 ScreenTape および試薬、Agilent Technologies – 米国カリフォルニア州サンタクララ) で定性的および定量的チェックを行った後、ライブラリーを等モル量でプールし、Illumina NovaSeq 6000 プラットフォーム上でペアエンドモードで 2 × 51+ 8+8サイクル65．

顕微鏡分析は、旧石器時代のサンプルについてはフィレンツェ大学のパリノロジー研究室で、新石器時代と銅器時代のサンプルについてはローマのサピエンツァ大学のDANTE-DietおよびANcient TECHnology研究室によって27のサンプルに対して行われました。私たちの経験に基づいて、適切な清潔な研究室で aDNA を抽出するために使用されたサンプルペレットから始めて、微小残骸を回収して分析することが可能です61。さらに、得られた結果をさらに比較するために、両方の原因 (つまり、歯石とペレット) について 6 つのサンプルを分析しました。

歯石のサンプリングは、Sabin と Fellow Yates 66 によって体系化されたプロトコールに従って行われましたが、多少の変更はありました (例、各サンプル抽出後に使い捨てブレードを交換したなど)。抽出と除染の手順は標準的な公開プロトコル66、67、68に従い、現代の植物研究とは関係のない専用の清潔なスペースで、厳格な環境監視の下で実施されました。現代のあらゆる種類の汚染を防ぐために、清掃が毎日行われました。各サンプルの分析前に、ベンチスペースの表面を石鹸とエタノールを使用して清掃し、アルミホイルで覆い、常に清潔でデンプンを含まないニトリル手袋を使用しました。結石の洗浄は、事前に洗浄したペトリ皿上で実体顕微鏡下で最大 100 倍の倍率で実施されました。歯石の表面に付着した石化土壌の除去は、滅菌ピンセットを使用してサンプルを保持し、細い鍼針を使用して石灰化歯垢の外層に付着した土壌を静かにこすり落とすことにより、細心の注意を払って行われました。この手順は、0.5 M HCl 酸を滴下して土壌の石灰化した斑点を溶解し、超純水を使用して脱灰をブロックし、洗浄して汚染物質を除去しました。除去された鉱物化土壌は、モニタリング分析のためにプラスチックチューブに保管されました。次に、きれいな結石を超純水で最大 3 回洗浄して、微量の遊離沈殿物を除去し、0.5 M HCl 溶液に溶解し、続いてグリセロールと超純水の 50:50 溶液を使用してスライドにマウントしました。さらに、現代のあらゆる種類の汚染を防ぐために、清潔な作業テーブルとダストトラップから対照サンプルが収集され、比較目的で分析されました。これは、季節を通じた汚染の流れをより深く理解できるようにするために、考古学的分析が行われていないときでも、私たちの研究室で日常的に行われている手法です。環境対照サンプルの遺骨と形態学的に類似した破片は回収されませんでした。でんぷん粒子は、実験室の「粉塵」のごくわずかな部分にすぎませんでした。ペレットを 10% HCl で 12 時間処理し、50% v/v 水-グリセリン溶液に加えました。分析は光学顕微鏡下、明視野光および交差偏光下で実施されました。結石マトリックスおよびペレットに埋め込まれた微小破片は、Zeiss Imager2 を使用して、倍率 100 倍から 630 倍まで分析されました。

考古学的なデンプン粒の同定には、地中海地域とヨーロッパに自生する 300 種の植物からなる現代の参考資料コレクション、出版された文献、および中央イタリア植物園 (FI) および大学の植物園から収集されたサンプルが使用されました。フィレンツェの30,38。胞子は、入手可能な文献との比較によって特定されました69。粒子群を存在としてカウントした。ファイトリスの命名法は ICBN 2.0 に従っていました。

メタゲノム配列はその品質を考慮して処理され、AdapterRemoval (v2.2.0)70 ソフトウェアを次のオプションで使用してアダプター配列がトリミングされ、ペアエンドリードが折りたたまれました: -minlength 30 –minquality 25 –trimns –trimqualities –collapse。次に、Prinseq71 (v 0.19.1) (https://prinseq.sourceforge.net/) を使用して重複配列が削除され、分類学的識別のために Kraken2 (v.2.0.8-beta) で分析されました 72。当社は、NCBI Reference Sequence (RefSeq) データベース (https://www.ncbi.nlm.gov/refseq/) から細菌、ウイルス、古細菌、およびミトコンドリアのゲノムのカスタムデータベースを作成し、2020 年 12 月に更新しました。誤った分類を避けるために、Dustmasker (v.1.0.0) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK569845/) を使用して、低複雑性領域の参照ゲノムをマスクしました。次に、Kraken2 の出力を Bracken ソフトウェア (v.2.5) を通じて分析し、種の読み取り存在量を推定しました 73 (補足データ 11)。これと同じアプローチが、探索的比較分析に使用される参照現代および古代マイクロバイオームのメタゲノムサンプルにも使用されており、補足表 3 で報告されています。データセット全体で 0.02 を超える相対存在量で存在する種を選択しました。このタイプの分類フィルターは、データセット内に存在する少量の種やシングルトンの影響を軽減するために提唱されており、古典的な希薄化アプローチよりも適しています 74,75。適用された閾値のおかげで、その後脱アミノ化プロファイルが検証され、その古代性が確認された 49 種が得られました。「参照」または「代表」として報告された種のみを使用して、各サンプルリードを NCBI RefSeq データベースに登録されているそれぞれの参照ゲノムと位置合わせしました。この目的には、高厳密性 (-n 0.1) の aln アルゴリズムを使用した Burrows-Wheeler Alignment (BWA v.0.7.15)76 プログラムが使用されました。次に、PMDtools (v.0.60) (–threshold 1 –requiremapq=30) (https://github.com/pontussk/PMDtools) を使用して、整列した配列のシトシン脱アミノ化プロファイルを調査しました。整列された種ごとに、bedtools (https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/) を使用して bam ファイルを bed に変換し、編集距離 (-tag NM) を推定しました。これはその後、距離アルゴリズム (–Δ%) を編集して、配列の信頼性をさらに確認します77。以前に報告したように、水平移動事象の可能性や、サンプルのマイクロバイオーム内の遺伝的に密接に関連した種の存在を評価するために、-Δ% > 0.8 を本物であると評価しました 78。各種およびすべてのサンプルの脱アミノ化プロファイルおよび –Δ% に関するすべての情報は、補足表 4 に報告されています。ここで調査したすべての異なる期間にわたるリードの断片化レベルと脱アミノ化プロファイルの差異をさらに評価し、時間の経過に伴うタフォノミックイベントの影響（補足図4および5）。

現代の汚染の可能性の範囲を調査し、古代のサンプルの口からの感染源を証明するために、得られたマイクロバイオームのプロファイルを現代と古代の両方のメタゲノムサンプルのプロファイルと比較しました。現代の糞便、土壌、皮膚および口腔（歯石と歯垢の両方）マイクロバイオームがヨーロッパヌクレオチドアーカイブから取得され、新しい環境および実験室対照が生成されました（補足表3）。プーリア州とマルケ州で直接サンプリングされた 2 つの土壌サンプルと、2 つの実験室対照 (つまり、抽出および配列決定プロセスから) を使用しました。さらに、他の研究から以前に報告された古代の口腔マイクロバイオームがさらなる対照として追加されました。 R ソフトウェア (v. 3.6.3) の phyloseq (v.1.30.0) パッケージを使用した種の分布に基づいて、ブレイ-カーティス距離のノンメトリック多次元スケーリングを通じて、現代および古代の参照に関するサンプルの位置を調査しました (補足説明）。さらに、Sourcetracker (https://github.com/danknights/sourcetracker) を使用して、Illumina プラットフォームを使用した散弾銃メタゲノムから得られた現代のマイクロバイオームのサブセットを考慮して、データセット内の口腔ソースの割合を推定しました。ソースとして読み取ります（SI、補足図2）。経口源が高い（>75%）ことを示すサンプルは、分析のために保存されました。最後に、汚染物質の可能性を排除するために、特定された種をヒト口腔マイクロバイオームデータベース (HOMD) と比較して、既知のヒト口腔種の選択を確実に行います。この意味で、問題となっている唯一の種は、環境細菌であり、ヒトの窩洞症の原因物質である Burkholderia pseudomallei でした 79。 Burkholderia 属は人間の口腔および歯垢から検出されています 80,81 が、歯石に関する B. pseudomallei の証拠はこれまでに報告されていないため、その存在が古代の汚染物質に関連しているかどうかを除外することはできません。

Bracken の出力は、R ソフトウェア (v. 3.6.3) を使用してサンプル間の種の分布を調査するために使用されました。まず、Aitchison が microViz パッケージ (v.0.9.0) を使用して導入した中心対数比 (clr) 変換を通じてデータを正規化しました。この変換により、データが対称、スケール不変、線形関係になり、データが対数比座標空間に配置されます82。このアプローチは、構成データの正規化に最も適したアプローチの 1 つです83。教師なしアプローチを通じてコホート内の考えられるグループの存在を調査するために、データセット内のクラスターの数を決定する標準的な方法であるギャップ統計を属レベルで実行しました84。クラスタパッケージ (v.2.1.0)85 の clusGap 関数を適用して、ブートストラップ 100 で phyloseq オブジェクト (v.1.30.0)86 のクラスタリング測定の良さを計算しました。次に、NetCoMi (v .1.0.2)87 を使用して、属レベルでのアイチソン距離に基づいてサンプルによって共有される関係を調査するためのネットワークを生成します。これは、データのサブセット化と集約にとってより安定しており、真の直線距離であるためです83。データは k 近傍 (k-nn) アルゴリズムでスパース化され、平均リンケージ法とギャップ統計によって得られた k 値を使用して階層的クラスタリング分析が適用されました (メソッド = "平均"、k = 5)。私たちはネットワーク分析を使用してサンプル間のつながり（距離だけでなく）を強調し、サンプルのマイクロバイオーム構成に基づいて既存のクラスターを特定しました。このアプローチをより古典的な分析でさらに裏付けるために、Aitchison 距離を使用して PCoA を実行し、PERMANOVA と ANOSIM を実行してネットワークによって識別されたクラスターの細分化を検証しました。また、読み取り数、抽出、ライブラリバッチの影響の可能性もチェックしました。ペアワイズ Adonis (https://github.com/pmartinezarbizu/pairwiseAdonis) を適用して、クラスターのペア間の違いを強調しました。

利用可能な数少ないメタデータ (つまり、期間、場所、死亡年齢、性別) のどれがクラスターの区別に主要な役割を果たしたかを理解するために、放射パッケージ ( v.1.4.0) (https://github.com/radiant-rstats/docs)。ランダムフォレストは、クラスターの結果を分類するために、作成されたモデルに対する各特徴の相対的な影響を特定しました。ランダムフォレスト分析から得られた分類モデルを検証するために、ピアソンのカイ 2 乗 (X2) 値を計算する vcd パッケージ (v. 1.4-9) の assoc 関数を使用して関連性テストを実行しました。カテゴリカルデータの独立モデル。

時間の経過とともに個体数が大きく変化した種を調査して特定するために、私たちは 2 つのアプローチを適用しました。 DESeq2 (v.1.26.0) を使用してクラスターの構成を比較し、偽の有意な結果の可能性を避けるために、調整された p < 0.05 を示し、複数の比較から有意性を示した種のみを有意なものとして受け入れました。次に、種とクラスターおよび期間変数との最も強い関連性を強調するために、線形モデル (MaAsLin v.1.0) による多変量解析を実行しました。この統計的枠組みは、臨床メタデータと微生物分類群の間の関連性を検出するために一般線形モデルを適用しており、現代の疫学研究で広く使用されています88。この分析に適用されたパラメータは次のとおりです。最大誤検出率 (有意性しきい値) は 0.05 でした。特徴相対存在量フィルタリングの最小値は 0.001 です。特徴普及フィルタリングの最小値は 0.01 です。異なって豊富な種は、口腔微生物群集を構成する生態学的複合体のメンバーシップに基づいて再グループ化されました27。

分類学的プロファイルに加えて、HUMAnN 2.089 を使用して実行された遺伝子内容の分析を通じて、マイクロバイオーム構成の変化が機能プロファイルの違いに対応するかどうかを評価しました。私たちはサンプル中の遺伝子含有量プロファイルを評価し、UniRef90_ko を使用してそれらを再グループ化しました。現代の汚染物質に関連する遺伝子内容の偏りを避けるために、取得したプロファイルをフィルタリングして、真に古代であることが以前に検証された種を選択しました。得られた KEGG (京都遺伝子ゲノム百科事典) オルソログ分布を LEfSe (v.1.0)90 を使用して比較し、p < 0.05 および LDA が 2 より高い結果のみを選択しました。病原性因子 (VF) の同定に関しては、検出された遺伝子重要なものとして、Chen らによって生成された毒性因子データベース (VFDB) からの情報を含むカスタムデータベースと照合されました 91。

全体として、プロットは ggplot2 (v.3.3.5)92 と色盲に優しいパレット 93 を使用して作成されました。

古代の口腔ゲノムの再構築は、Wibowo らの研究に従って進められました。コンティグ検証用の Pipeline9。各サンプルは、--meta オプションを指定した SPAdes94 (v.3.15.3) を使用してアセンブルされました。各サンプルは、デフォルト設定の Bowtie2 (v.2.3.5.1)95 を使用して、相対的にアセンブルされたコンティグに対してマッピングされました。出力は、SAMtools (v.1.9)96 によってインデックス付けおよび並べ替えられ、生成された BAM ファイルは MetaBAT 2 (v.2.12.1)97 を使用して順次ビン化されました。アセンブリ品質の評価は、CheckM (v.1.1.6)98 の系統固有のワークフローを介して実行され、ゲノムの完全性、汚染レベル、カバレッジ、N50 値、平均コンティグ長および最大コンティグのサイズがテストされました (補足表を参照) S5)。次に、組み立てられたコンティグは、Kraken2 による分類学的同定に使用されました。以下の分析では、完全性レベルが 85% を超え、汚染レベルが 5% 未満、分類学的同定が 95% を超えるゲノムのみが考慮されました。最後に、aDNA 損傷プロファイルを評価するために、Wibowo らのdamageprofiler.sh スクリプトを使用します。が使用されましたが、スクリプトの最後の部分は PMDtools を使用して変更されました。各サンプルの脱アミノ化プロファイルのプロットを補足図13に報告しました。参照に対するコンティグのアライメントは、BLAST Ring Image Generator (BRIG) (v.0.95)99を使用して、70％および30％の上限および下限の同一性しきい値を使用して実行されました。％、それぞれ。このソフトウェアは、図5と補足図14の両方を生成するために使用され、後者にはNCBIデータベースによって取得された参照遺伝的注釈が含まれています。

次に、コンティグを PATRIC (v.3.6.12)100 にアップロードして、さらなるアノテーション、系統発生およびプロテオーム分析を行いました。特に、再構成された 6 つのゲノムすべてに、RASTtk101 を使用して PATRIC ワークスペース内でゲノム特徴の注釈が付けられました。系統樹は、23 の最新のゲノム参照と 159 の遺伝子を使用して、RAxML (v.8.2.11)102 を通じて構築されました。次に、プロテオーム比較ツールを使用して、親参照との古代タンパク質の類似性を調査し、機能と欠落領域を特定しました。 BLASTP アルゴリズムを使用して、参照ゲノムと比較したときに、タンパク質配列が一意であるか、一方向のベストヒットであるか、または双方向のベストヒットであるかとして比較します。 Protein Family Sorter ツールは、現代の参照と比較して、古代サンプル間で属境界 (PGF) を越えるタンパク質ファミリーの分布を調査するために使用されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究のために生成されたすべての配列データは、BioProject PRJNA791766 の下で NCBI Sequence Read Archive (SRA) に保管されています。処理されたデータ、顕微鏡データ、ゲノムアセンブリおよび注釈データは、論文とその補足データファイルに含まれています。考古学サンプルは、バーリ（イタリア）の「バーリ大都市の考古学、美術、景観の監督」、およびバルレッタ、アンドリア、トラーニ、フォッジャの各県の考古学、美術、景観の監督で収集されました。フォッジャ（イタリア）の「考古学、美術、行進の風景監督」、アンコーナ（イタリア）の「起源博物館」、ローマ（イタリア）の「ラ・サピエンツァ」大学の「起源博物館」、そしてローマ（イタリア）の博物館「文明博物館」。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

コードは https://github.com/AndreaQ7/HuME および Zenodo103 (https://doi.org/10.5281/zenodo.7198970) で入手できます。

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サーバーに関するサポートをしていただいた Matteo Tuzzato 博士に感謝します。私たちは、「Soprintendenza Archeologia, Belle Arti e Paesaggio per la Città Metropolitaa di Bari」、「Soprintendenza Archeologia, Belle Arti e Paesaggio per le Province di Barletta-Andria -Trani e Foggia」、「Soprintendenza」の考古学者と人類学者に感謝します。 Archeologia、Belle Arti e Paesaggio delle Marche」と実りあるコラボレーションを行っています。私たちは、グロッタ・パグリッチでの研究に対して A. パルマ・ディ・チェスノーラ氏、そして遺体の整理に貢献してくれた G. カペッキ氏に感謝します。また、参考資料を提供してくださった SMA - Museo di Storia Naturale di Firenze (Herbarium Centrale Italicum および植物園) のスタッフにも感謝します。このプロジェクトは、パドヴァ大学から AQ (イタリア) への STARS 2019 プログラムによって資金提供されました。フィレンツェ大学の生物学部で行われた分析は、フィレンツェ大学の内部助成金によってカバーされました (Progetto Strategieso di Ateneo anno 2014 n. 129323、2015 年 5 月 10 日、ML に割り当てられました)。新石器時代の歯石中の微小破片の分析は、Horizon 2020 Framework Program (EC への補助金プロジェクト HIDDEN FOODS 補助金契約番号 639286 の開始) に基づいて欧州研究評議会 (ERC) から資金提供を受けています。

これらの著者は同様に貢献しました: Italo Maria Muntoni、Martina Lari。

パドヴァ大学比較生物医学・食品科学学部、レニャーロ、35020、イタリア

アンドレア・クアリアリエロ、ガブリエル・イノチェンティ、マリア・エレナ・マルティーノ

生物学部、分子人類学および古遺伝学研究室、フィレンツェ大学、フィレンツェ、50122、イタリア

アレッサンドラ・モディ、ヴァレンティーナ・ザロ、デヴィッド・カラメリ、マルティナ・ラリ

ローマ大学「サピエンツァ」古代科学部、ローマ、00185、イタリア

セシリア・コナティ・バルバロ

物理、地球および環境科学部、UR 先史および人類学、シエナ大学、シエナ、53100、イタリア

アンナマリア・ロンキテッリ、フランチェスコ・ボシン、ステファノ・リッチ

歴史文化文明学部、ボローニャ大学、ボローニャ、40126、イタリア

クラウディウス・カヴァズーティ

バーリ大都市圏のABAP監督、バーリ、70121、イタリア

エレナ・デルー & フランチェスカ・ラディーナ

生物考古学のセクション - 文明博物館、ローマ、00144、イタリア

アレッサンドラ・スペルドゥティ & ルカ・ボンディオーリ

ナポリ大学「ロリエンターレ」アジア・アフリカ・地中海学部、ナポリ、イタリア

アレッサンドラ・スペルドゥティ

パドヴァ大学文化遺産学部、パドヴァ、35139、イタリア

ルカ・ボンディオーリ

フィレンツェ大学生物学部パリノロジー研究室、フィレンツェ、50121、イタリア

ミリアム・ログノーリ & マルタ・マリオッティ・リッピ

ボローニャ大学、生物学、地質および環境科学部、ボローニャ、40126、イタリア

マリア・ジョヴァンナ・ベルカストロ & ヴァレンティーナ・マリオッティ

ダンテ - ローマ大学「サピエンツァ」顎顔面科学科、食事と古代技術の研究室、ローマ、00161、イタリア

エマヌエラ・クリスティアーニ

バルレッタ、アンドリア、トラーニ、フォッジャ各県の考古学、美術、景観の監督、フォッジャ、71121、イタリア

イタロ・マリア・ムントーニ

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AQ、IMM、ML がこの研究を発案しました。 AQ と AM は歯石サンプルを収集しました。 AM と VZ は MLAQ の監督下で DNA 抽出と配列決定を実行し、GI はバイオインフォマティクス分析を実行しました。 MML、EC、M.Lo。微小遺骨の分析を行った。 CC、ED、FR、AS、LB、MGB、VMは、新石器時代と銅器時代のさまざまな遺跡からの人間の遺体の研究を実施しました。 IMM と CCB は、新石器時代と銅器時代の遺跡の科学的責任を負っています。 AR と FB は、パグリッチ洞窟の研究を科学的に担当しています。 SR は、パグリッチ洞窟からの人骨の解剖学的識別と研究を実施しました。 AQ、AM、EC、MML、および ML は、VZ、CCB、AR、FB、DC、MEM、および IMM の協力を得て論文を執筆しました。著者全員が原稿を修正し、承認しました。

アンドレア・クアリアリエロまたはアレッサンドラ・モディへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Nicolas Rascovan と他の匿名の査読者に感謝します。

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クアリアリエロ、A.、モディ、A.、イノチェンティ、G. 他古代の口腔マイクロバイオームは、新石器時代の食事の農業への段階的な移行をサポートしています。 Nat Commun 13、6927 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-34416-0

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受理日: 2022 年 10 月 25 日

公開日: 2022 年 11 月 22 日

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